脂肪基质细胞诱导分化为胆碱能神经元细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 44-49.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.007

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脂肪基质细胞诱导分化为胆碱能神经元细胞

邓春颖¹，刘斌¹，张志勇²，张玉芹¹，李燕¹，伊红丽¹

1河北联合大学附属医院神经内一科，河北省唐山市 063000
2河北联合大学附属医院神经外科，河北省唐山市 063000

收稿日期:2012-05-13 修回日期:2012-06-20 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 刘斌，硕士，教授，主任医师，河北联合大学附属医院神经内一科，河北省唐山市 063000 liubintsh@126.com
作者简介:邓春颖★，女，1984年生，河北省三河市人，汉族，河北联合大学在读硕士，主要从事神经疾病相关研究。 dengchunyingyu@163.com
基金资助:
河北省自然科学基金(C2008000994)。

Adipose-derived stromal cells differentiate into cholinergic neurons

Deng Chun-ying¹, Liu Bin¹, Zhang Zhi-yong², Zhang Yu-qin¹, Li Yan¹, Yi Hong-li¹

1 First Department of Neurology, Affiliated Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China
2 Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2012-05-13 Revised:2012-06-20 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Liu Bin, Master, Professor, Chief physician, First Department of Neurology, Affiliated Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China liubintsh@126.com
About author:Deng Chun-ying★, Studying for master’s degree, First Department of Neurology, Affiliated Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China dengchunyingyu@163.com
Supported by:
Hebei Natural Science Foundation, No. C2008000994

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪基质细胞具有多向分化潜能，在特定条件下，可分化为中胚层起源组织的细胞及内、外胚层起源组织的细胞，在一定条件下可分化为胆碱能神经元。
目的：探讨脂肪基质细胞的体外培养及其向胆碱能神经元细胞分化的能力。
方法：取2-4周龄的SD大鼠腹股沟皮下脂肪垫，体外分离培养并传代，神经诱导培养基诱导培养后，免疫细胞学检测CD29、CD31和CD44的表达，进行表型鉴定。
结果与结论：脂肪基质细胞在体外培养过程中贴壁生长，增殖能力强，其表面标记物CD29、CD44表达阳性，CD31表达阴性。经神经诱导培养基诱导培养后，分化的细胞大部分呈典型的神经元样细胞形态，巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2表达阳性。诱导分化后胆碱乙酰转移酶表达阳性。说明脂肪基质细胞可分化为神经元样细胞，分化后的细胞具有合成胆碱乙酰转移酶的功能。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 胆碱能神经元, 脂肪基质细胞, 诱导, 分化, 大鼠, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stromal cells have multilineage differentiation potential, and it can differentiate into mesodermal cells and endodermal and ectodermal cells. Under certain conditions, they can differentiate into cholinergic neurons.
OBJECTIVE: To explore in vitro culture of adipose-derived stromal cells and their ability to differentiate into cholinergic neurons.
METHODS: Subcutaneous inguinal fat pads from 2-4 week-old Sprague-Dawley rats were taken and then in vitro isolated, cultured and passaged. After induced and cultured with neural induction medium, CD29, CD31 and CD44 expressions was detected by immunocytochemical tests and the phenotypic identification was performed.
RESULTS AND CONCLUSION: During the in vitro culture, adipose-derived stromal cells adhered to culture flask wall, proliferated strongly, and they were positive for CD29 and CD44, but negative for CD31.
After induced and cultured with neural induction medium, the differentiated cells showed a typical neuron-like cells morphology, and the expression of nestin, neuron-specific enolase and microtubule-associated protein 2 was positive. The expression of choline acetyltransferase was positive after induction and differentiation. It indicates that adipose-derived stromal cells can differentiate into neuron-like cells and the differentiated cells have the function of synthesizing choline acetyltransferase.

Key words: stem cells, adipose-derived stem cells, cholinergic neurons, adipose-derived stromal cells, induction, differentiation, rats, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

邓春颖，刘斌，张志勇，张玉芹，李燕，伊红丽. 脂肪基质细胞诱导分化为胆碱能神经元细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 44-49.

Deng Chun-ying, Liu Bin, Zhang Zhi-yong, Zhang Yu-qin, Li Yan, Yi Hong-li. Adipose-derived stromal cells differentiate into cholinergic neurons[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 44-49.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪基质细胞的形态变化原代细胞镜下观察呈圆形，悬浮状态，混有少量杂质细胞及脂滴，24 h后大量细胞贴壁生长，呈梭形，形态较均一，7-10 d即达到80%融合，呈漩涡状排列，见图1a。

传代细胞呈圆形，悬浮状态，贴壁后的细胞生长比原代快，随着传代，细胞得到纯化，最终呈长梭形，漩涡状生长，见图1b。

图1 倒置显微镜下观察大鼠脂肪基质干细胞的细胞形态

Figure 1 Morphological observation of adipose-derived stromal cells under inverted microscope

2.2 脂肪基质细胞的细胞表型鉴定实验通过胶原酶消化法，对脂肪基质干细胞进行了成功的分离培养，免疫细胞学检测结果显示：贴壁细胞强表达CD29和CD44，不表达CD31，见图2。

图2 大鼠脂肪基质干细胞表型鉴定

Figure 2 Identification of phenotype of adipose-derived stromal cells

2.3 脂肪基质细胞诱导分化后的形态变化加入诱导培养基1 h，细胞形态即发生显著变化。细胞体积缩小，胞质以胞核为中心收缩并向两侧延长，细胞体逐渐形成球形并形成突起，立体感增强，折光性增加，随着时间进展，具有神经细胞形态特点的细胞数量逐渐增多，形成双极或多极细胞，细胞发起的各个突起互相交织成网，见图3，4。

图3 大鼠脂肪基质干细胞诱导分化后交织成网(苏木精-伊红染色，×100)

Figure 3 Adipose-derived stromal cells were interwoven into a network after induction (hematoxylin-eosin staining, ×100) 图4 倒置显微镜下观察大鼠脂肪基质干细胞诱导后细胞形态

Figure 4 Morphological observation of adipose-derived stromal cells after induction under inverted microscope

2.4 免疫组化法和免疫荧光染色检测细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2和胆碱乙酰转移酶的表达免疫组化、间接免疫荧光结果见图5，6。

图5 神经诱导培养基诱导24 h后脂肪基质细胞各类蛋白酶的表达(免疫组化染色，×100)

Figure 5 Expression of various proteases of adipose-derived stromal cells after induced and cultured with neural induction medium for 24 h (immunohistochemical staining, ×100) 图6 神经诱导培养基诱导24 h后脂肪基质细胞各类蛋白酶的表达(免疫荧光染色，×100)

Figure 6 Expression of various proteases of adipose-derived stromal cells after cultured with neural induction medium for 24 h (immunofluorescent staining, ×100)

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察实验。

时间及地点：实验于2010年3月至2011年12月在河北联合大学实验中心完成。

材料：

实验动物：清洁级健康2-4周龄SD大鼠30只，雌雄不限，体质量100-120 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号：0163923)，实验中对动物的处置符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导意见》的相关要求^[6]。

方法：

神经诱导培养基(NIM)的配制：BHA 200 μmol/L、KCl 5 mmol、丙戊酸钠 2 mmol/L、forskolin 10 μmol/L、氢化液体可的松1 μmol/L、胰岛素5 mg，其中BHA先用50 mL乙醇溶解后，分别与上述试剂加入α-MEM培养基中，充分溶解后α-MEM定容至1 L，蔡氏滤器过滤后，分装，-20 ℃保存。

脂肪基质细胞的分离、培养及表型鉴定：颈椎脱臼处死动物，无菌条件下取出腹股沟脂肪垫，用眼科剪将脂肪组织尽量剪碎，然后浸泡在胶原酶消化液(含有 250 U/mLⅠ型胶原酶，体积分数1% BSA) 中，37 ℃恒温振荡搅拌20-50 min。消化后低温高速离心倒掉上层脂肪组织及上清液，将沉淀的细胞团块用红细胞裂解液重新悬浮再离心弃上清，含血清的DMEM培养基悬浮吹打后，100目筛网过滤后离心弃上清，含血清的DMEM培养基悬浮吹打，种植于50 mL细胞培养瓶中，置于 37 ℃、体积分数为5%的CO₂孵育箱中，24 h后首次换液，以去除残余杂质细胞及未贴壁的细胞，以后每两三天换液1次，约1周后细胞在培养瓶底层基本融合时胰酶-EDTA溶液进行传代培养。

在倒置相差显微镜下连续观察原代及传代后的脂肪基质细胞生长情况和形态变化，照相记录。将第3代的脂肪基质细胞采用胰酶消化，传第4代细胞至已预先放入无菌盖玻片的6孔培养板中，制备细胞爬片，进行免疫组化染色，观察CD29、CD31和CD44的表达情况。

脂肪基质细胞向神经细胞的诱导分化：经3次传代后，脂肪基质细胞纯化并进行诱导实验。将第3代大鼠脂肪基质细胞采用胰酶消化传至第4代并接种于预置无菌盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，待细胞达70%-80%融合时，加入诱导培养基。倒置相差显微镜下观察细胞形态，判断细胞分化的标准是细胞具有1个以上的突起，且突起的长度至少是胞体直径的2倍^[7]。

免疫组化法和免疫荧光染色检测细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2和胆碱乙酰转移酶的表达：用免疫组化法和免疫荧光技术鉴定神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白，神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2和神经递质胆碱合成过程中的关键酶胆碱乙酰转移酶的表达情况。

方法如下：细胞漂洗，40 g/L多聚甲醛固定细胞 30 min漂洗，0.1% Triton-X-100的PBS孵育10 min漂洗，体积分数3%H₂O₂ 孵育10 min漂洗，加入山羊血清孵育15 min，加入一抗巢蛋白(1∶200)，神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2、胆碱乙酰转移酶(均为 1∶100)，阴性对照以PBS代替一抗。4 ℃过夜，漂洗，滴加PV6001/PV6002试剂盒中的二抗，室温孵育 15 min，PBS漂洗。DAB液显色，苏木精复染，封固。显微镜下观察拍照。免疫荧光步骤同上，二抗为FITC标记抗体，荧光显微镜下观察并拍照。

主要观察指标：①倒置显微镜观察脂肪基质细胞及诱导后的脂肪基质细胞生长和形态学变化。②免疫组化法鉴定脂肪基质细胞的细胞表型。③免疫组化法和免疫荧光法检测诱导的神经球巢蛋白、微管联合蛋白2、神经元特异性烯醇化酶表达和胆碱能神经元胆碱乙酰转移酶的表达。

讨论

脂肪基质细胞作为脂肪来源的干细胞，具有体外增殖及多系统分化的潜能^[8-10]，它是一群由多种细胞组成的混杂体，包括不同分化阶段的前成脂细胞、周皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞及多潜能干细胞。由于其来源于中胚层，但能跨胚层向神经细胞分化，故有将这种分化形式称为“横向分化”^[11]。目前多数学者选择脂肪基质干细胞来研究细胞移植技术，主要是由于脂肪组织来源丰富、获取容易、易于分离培养，在体外具有很强的增殖能力、多向分化潜能及自体移植无免疫排斥反应等^[12]。

脂肪基质细胞在鼠白色脂肪组织中的含量高且有较强的分化潜能^[13]。本实验通过胶原酶消化法，对脂肪基质干细胞进行了成功的分离培养，经免疫细胞学检测强表达CD29和CD44，不表达CD31，与De Ugarte等^[14]的研究结果相同。CD29是识别整合素印亚单位的蛋白，广泛分布于各种细胞和组织中，但在红细胞阴性。CD44是基质细胞表面抗原，CD31是高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。本实验选取的表面标记物已有文献报道，实验结果与相关文献报道结果一致^[15-17]。本实验免疫细胞学检测结果显示：贴壁细胞强表达CD29和CD44，不表达CD31，说明所获得的细胞是非来源于血液细胞类的基质细胞类。

已有文献报道传至第四五代的细胞已经基本没有杂质细胞^[18-19]。在Kang等^[20]研究中发现，传代和换液可以起到对细胞的纯化作用，传代到第3代细胞的时候，几乎已经没有杂质细胞，所以实验选用第4代细胞进行诱导实验。采用神经诱导培养基对第4代脂肪基质干细胞进行诱导培养后，免疫组化法检测巢蛋白的表达。有研究表明只有将骨髓间充质干细胞诱导成巢蛋白表达阳性的细胞后才能向神经元分化^[21-22]，本实验免疫组化结果巢蛋白阳性表达，说明一部分脂肪基质细胞转化为神经干细胞，并可进一步向神经元分化。神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2均有阳性表达，神经元特异性烯醇化酶存在于神经元和内分泌细胞中，是糖酵解途径中的酶，是神经元的标志酶，胶质细胞和其他神经组织中不含这种酶^[23]；微管联合蛋白2是一种微管结合蛋白，主要存在于神经元突起和胞体，参与神经元和非神经元细胞极性的形成，其与微管蛋白结合，参与微管形成。实验中免疫荧光染色巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2均显示胞浆内有绿色荧光颗粒，证明均在胞浆内阳性表达。神经前体细胞的标志性蛋白巢蛋白染色阳性，经诱导分化后，表达神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2。说明实验分离的细胞为脂肪基质细胞，且其可向神经元样细胞分化。

乙酰胆碱是胆碱能神经元发挥作用的一种重要介导物质，其含量标志着胆碱能系统的功能状态，但其释放后即被胆碱酯酶降解，很不稳定，而胆碱乙酰转移酶较稳定，其含量可以间接反映胆碱能系统的功能状态^[24]。实验采用免疫组化法和免疫荧光技术检测诱导后的神经细胞特异性标志物及神经递质胆碱合成过程中胆碱乙酰转移酶均有阳性表达，说明脂肪基质细胞可向胆碱能神经元样细胞分化，且分化后的细胞具有合成胆碱乙酰转移酶的功能。

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已发表杂志：中国美容医学.2011,(20)8:1232-37

主要观察指标：将腹部取皮术的皮下脂肪利用胶原酶消化法，进行体外分离培养，取第3代的细胞进行细胞爬片HE 染色、流式鉴定、MTT、细胞周期检测等，利用成脂和成骨培养液诱导，油红O 和茜素红染色鉴定诱导结果。

结论：原代培养第1 次换液时细胞多呈多角形和短梭形，第3 代ASCs 细胞爬片HE 染色显示形态多为长梭形，呈漩涡状生长；流式鉴定显示：CD29＋，CD31－，CD34－，CD44＋，CD45－，CD49＋，CD106－，CD133－；MTT 显示ASCs 生长增殖活性强；细胞周期检测结果显示：G1=86.8%，G2=8.77%;成脂诱导后油红O 染色阳性，对照组为阴性；成骨诱导后茜素红染色阳性，对照组为阴性。

已发表杂志：Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2011，25（12）:1486-92

主要观察指标：联合CD44、CD106 免疫荧光染色和成脂诱导分化鉴定ADSCs。MTT 法检测细胞增殖情况；RT-PCR 检测诱导细胞骨钙素（osteocalcin，OC）和核心结合因子α1（core binding factor α1，Cbfα1）的表达；测定ALP 活性及矿化面积百分率；对矿化结节行茜素红染色。

结论：成骨培养液中地塞米松浓度为1 × 10^-⁸ mol/L 时，能在减少对细胞增殖抑制的同时，更有效地诱导ADSCs 成骨分化。

已发表杂志：中国实用医药.2012,7(1):3-5

主要观察指标：取人抽脂术后的无菌脂肪组织，酶消化法分离培养hADSCs，观察细胞形态，MTr法检测细胞增殖能力。用含0、50、100 ns／ml GDF-5的软骨诱导液培养，观察形态变化，检测Ⅱ型胶原及GAG的表达。

结论：hADSCs呈长梭形，P10以后仍具有较强的增殖能力。经GDF-5诱导的hADSCs逐渐变为圆形、多角形，部分细胞聚集生长，形成软骨样结节；诱导28 d的细胞Ⅱ型胶原表达阳性，甲苯胺蓝将GAG染成蓝色，但100 ng／ml GDF-5诱导组阳性表达明显高于50 ns／n~诱导组。hADSCs在100 ng／ml GDF-5的诱导下可分化为软骨样细胞。

已发表杂志：Exp Neurol.2007;207(2):267-274

主要观察指标：免疫细胞化学染色和Western印迹表明，处理后的细胞表达神经胶质标记，GFAP，S100和P75。

结论：脂肪组织中含有的再生干细胞可以分化为雪旺表型细胞，能为周围神经损伤提供治疗方案。

脂肪基质细胞诱导分化为胆碱能神经元细胞

Adipose-derived stromal cells differentiate into cholinergic neurons

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